摘要：癌症患者外周血中循环肿瘤细胞（CTC）的数量可以作为癌症诊断和治疗监测的有价值的生物标志物。在这项研究中，我们实施了一个定制设计的视频速率共聚焦显微镜系统，能够在活体动物模型的大隐静脉 (GSV) 处直接可视化快速流动的CTC。在 GSV 连续采集视频速率图像揭示了静脉注射循环肿瘤细胞数量的高度动态时间依赖性变化。通过对静脉注射的长循环红细胞的血细胞计数分析提取校准因子，我们建立了一种新的体内全身血液中CTC 的定量方法。在过去的十年中，已经开发了几种从外周血样本中检测 CTC 的技术，包括 FDA 批准的 CellSearch 系统 (Veridex) [9, 11]、微流体平台 [12, 13]、基于芯片的诊断 MRI。 DMR) 生物传感器 [14] 和实时 PCR [15]。然而，那些离体使用从患者身上抽取的外周血样本的技术在 CTC 检测中的成功率很低。这主要是由于两个组合的限制因素。一是允许从患者身上抽取的血液量有限（每次抽取约 10 毫升），二是血液中的 CTC 极为罕见（每毫升血液中少于一个 CTC [16, 17]）。这些因素使得大多数癌症患者的血液样本中只存在少数 CTC，这是建立离体的主要障碍CTC检测技术作为癌症治疗的常用工具。需要注意的是，这些限制因素可能会更不利地限制从癌症相对早期阶段（例如 2B 和 3 期）或部分缓解患者（密切监测癌症进展和疗效）患者的血液样本中检测CTC抗癌治疗，可能使用 CTC 作为替代标志物，可能提供最深刻的临床益处。
能够直接检测活体动物血管中循环肿瘤细胞的体内流式细胞术 (IVFC) [18-21] 可能是克服这些障碍的方法之一。如果有足够的时间，IVFC 可以分析比离体检测技术大得多的血液，因为它不仅限于小体积的离体血液样本，而是分析体内血管内连续流动的血液[22-24]。然而，以往的报道大多集中在直径为几十微米的小毛细血管，其中血流速度很慢（100-200μm/sec）；因此，在给定时间内分析的分析血量是最小的。部分原因是普通激光扫描显微镜系统的图像采集速度较慢，因此难以检测和定量较大血管中快速流动的细胞，其中血流速度更快（> 2mm / sec）。需要注意的是，CTC 的光声检测已经在快速流动的大血管（例如 0.9 mm 主动脉）上进行 [25, 26]，尽管它没有捕获原位流动的 CTC 的图像。尽管如此，大多数在体内流式细胞术研究检测到流动的 CTCs 是连续检测到的信号中的突然尖峰。但它只提供了通过血管内外部光焦点体积的荧光物体的数量信息，缺乏细胞大小和亚细胞特征等形态学信息，以及血液中CTC行为的动态信息。更重要的是，最近的研究报道了血液中 CTC 簇的动态形成 [27-29] 及其对增加转移风险的影响 [30, 31]。总的来说，一种直接成像方法可以捕获流动的 CTC 及其簇的显微图像，优先在血流速度快的大血管中，以在给定时间内分析更多的血量，在这项研究中，我们实现了一个基于快速旋转多面镜的定制设计小动物活体原位细胞分析成像系统。该系统可以以视频速率（每秒 30 帧）获取 512x512 像素大小的亚微米分辨率图像。它使我们能够对直径通常约为 500 μm 的大隐静脉 (GSV) 中快速流动的单个细胞进行直接实时成像。GSV 循环的血液比小毛细血管多三个数量级，为 IVFC 分析提供显着增加的血液量。为了验证所实施系统在 GSV 直接成像 CTC 的能力，我们静脉注射了用绿色荧光染料标记的 CT26 结直肠癌细胞，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 并成功获得了 GSV 中流动 CT26 细胞的清晰图像。我们不断获取 GSV 的视频速率图像，这揭示了循环 CT26 细胞数量的高度动态的时间依赖性变化。在GSV检测到的流动CT26细胞数量在注射后立即稳定增加，并在注射后1.5分钟达到最大值，因为它需要一些时间才能与体内系统循环的血液均匀混合。然后，有趣的是，由于静脉注射突然暴露在恶劣的血液循环环境中的 CT26 细胞被大量破坏，它在 2 分钟内迅速下降到最大值的 10% 以下。同时我们观察到大量的小尺寸荧光颗粒，推测是CT26细胞在血液循环中被破坏的细胞碎片。事实上，随着循环CT26细胞的减少，小碎片也在2分钟内迅速消失。另一方面，当我们静脉注射用远红荧光团-DiD荧光标记的红细胞（RBC）时，在GSV处检测到的流动红细胞数量增加，并在1.5分钟时达到最大值，与CT26细胞一样。然后，与CT26细胞的观察相反，检测到的红细胞数量在60分钟内保持在最初达到的最大值，表明静脉注射后红细胞在血液循环中的长期存活。这种观察是相当合理的，因为红细胞可以自然地维持血液循环中的恶劣环境。值得注意的是，根据预先确定的在血液循环中稳定维持的注射红细胞总数，我们可以计算动态变化的 CT26 细胞数量之间的相对校准因子，并估计全身血液中循环 CTC 的总数在体内。2. 实验装置和方法
2.1.小动物活体原位细胞分析成像系统
图 1. 活体定制视频速率激光扫描共聚焦显微镜系统示意图和小鼠腿大隐静脉 (GSV) 示意图：ND，中性密度滤光片；DBS，二向色分束器；BPF，带通滤波器；M，镜子；PMT，光电倍增管；OBJ，物镜。我们的活体成像平台是通过修改以前开发的定制视频速率共聚焦激光扫描显微镜系统来实现的 [32, 33]。图 1 显示了成像系统的示意图和位于小鼠腿上的大隐静脉的图示。激发激光束路径用实线表示，发射的荧光束路径用虚线表示。激发光源采用由488nm二极管激光模块（MLD488，Cobolt）、561nm DPSS激光器（Jive，Cobolt）和640nm二极管激光模块（MLD640，Cobolt）组成的三个连续波激光源。每个激光的强度由中性密度滤光片（Thorlabs，NDC-50C-4M-A）独立调节。使用二向色分束器 (DBS1; FF593-Di03, DBS2;FF520-Di02, Semrock），然后传送到多边二向色分束器（DBS3；Di01-R405/488/561/635，Semrock）。共线对齐的激光束由快速旋转的 36 面多面镜（MC-5，铝涂层，林肯激光器）和振镜扫描仪（6230H，Cambridge Technology）扫描，生成二维光栅扫描图案。扫描激光束通过商用长工作距离高 NA 物镜 (LUCPLFLN 40X, 0.60NA, Olympus) 传送到 XYZ 平移台 (3DMS, Sutter Instrument) 上麻醉小鼠的大隐静脉 (GSV),它提供了 250 × 250 μm 的视野。DBS3 对来自样品的三色荧光信号进行去扫描并从激发激光束中分离出来。然后，信号被二向色分束器（DBS4；FF560-Di01，DBS5；FF649-Di01，Semrock）和带通滤光片（BPF1；FF01-525/ 45，BPF2；FF01600/37，BPF3；FF01-697/58，Semrock）。共焦针孔（#39-880，Edmund optics）被放置在每个用作荧光检测器的光电倍增管（PMT；R9110，Hamamatsu）的前面。我们使用比艾里斑尺寸（300 μm）大得多的针孔来增加 z 切片厚度以具有大的检测体积。用于检测的 z 切片厚度测量为 8 μm。PMT 的电子输出使用 8 位分辨率的 3 通道图像采集卡（Solios，Matrox）进行数字化，每个通道的采样率为 10 MHz。2.2.细胞培养和荧光标记
在这项研究中，将 CT26 鼠结肠癌细胞系维持在含有 10% 胎牛血清 (FBS; Invitrogen) 和 1% 青霉素-链霉素 (Invitrogen) 的 RPMI 1640 培养基 (Invitrogen) 中，并保持在 37 ℃的 5% CO2 培养箱中。摄氏度。通过用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen) 进行胰蛋白酶消化收获 CT26 细胞并重悬于生长培养基中。用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯 (CFSE; Invitrogen) 对重新悬浮的 CT26 细胞进行荧光标记。使用死细胞染色试剂盒确认标记后细胞存活率超过 95%。同样地 CT26 细胞，为了在 GSV 下观察快速流动的红细胞，从麻醉小鼠的眶后窦抽取 10μl 血液，并用1,1' -dioctadecyl3,3,3 ' ,3 '进行荧光标记-四甲基吲哚-二羰花青-高氯酸盐（DiD；Invitrogen）。标记的 CT26 细胞和红细胞在静脉注射到麻醉小鼠的侧尾静脉之前保持在 4°C。2.3.动物成像程序
使用10~12周龄的BALB/c小鼠。通过肌肉内注射甲苯噻嗪（10 mg/kg）和唑来替尼（30 mg/kg）来麻醉小鼠。用理发器和脱毛膏去除大腿上的毛发。通过做一个小皮肤切口并去除皮下脂肪组织来手术暴露 GSV。尾静脉导管用于注入荧光剂和细胞。静脉注射四甲基罗丹明 (TAMRA) 葡聚糖缀合物 (D-7139, Life Technology) 以标记血浆，从而识别 GSV 进行成像。找到 GSV 后，精确操纵 3D 平移台以将 GSV 放置在成像视野的中心。将z轴成像焦平面的位置调整为位于GSV壁内60μm处。开始视频速率共聚焦电影录制后，通过尾静脉导管静脉注射荧光标记的CT26细胞和红细胞。在物镜下方测量的激发激光功率在 488 nm、516 nm 和 640 nm 处分别为 1 mW、0.4 mW 和 0.5 mW。在成像期间，通过使用恒温控制系统（PhysioSuite，Kent Scientific）将小鼠体温保持在 37°C。GSV 周围暴露组织区域的温度也用温盐水和额外的热垫保持在 37°C。动物护理和所有实验均经 KAIST 动物护理委员会批准（协议编号 KA2011-36）。分别。在成像期间，通过使用恒温控制系统（PhysioSuite，Kent Scientific）将小鼠体温保持在 37°C。GSV 周围暴露组织区域的温度也用温盐水和额外的热垫保持在 37°C。动物护理和所有实验均经 KAIST 动物护理委员会批准（协议编号 KA2011-36）。分别。在成像期间，通过使用恒温控制系统（PhysioSuite，Kent Scientific）将小鼠体温保持在 37°C。GSV 周围暴露组织区域的温度也用温盐水和额外的热垫保持在 37°C。动物护理和所有实验均经 KAIST 动物护理委员会批准（协议编号 KA2011-36）。2.4.图像处理
为了对完整循环细胞进行可靠定量，我们设计了一种图像处理算法来区分小颗粒和合理细胞大小的物体。在从 GSV 获取实时视频速率电影后，使用 Matlab (Mathworks) 的自定义编写代码执行图像处理。为了分析 GSV 中检测到的流动细胞数量的时间依赖性变化，从静脉注射后立即持续记录 AVI 格式的视频（30 帧/秒）直到 20 分钟。首先，视频被转换成单独的图像序列。所有图像都应用了大小为 3 的 2D 中值滤波器以消除孤立的散斑噪声，并通过 50% 的阈值化转换为二值图像。从每张图片来看，通过使用图像处理工具箱中的 Matlab 函数 BWCONNCOMP 自动识别所有连接的组件，并以像素数为单位计算它们的面积。由于像素大小是预先表征的，我们可以确定每个组件的大小。在去除所有小于完整细胞的合理尺寸的成分（推测为细胞碎片）后，剩余成分的数量被计为完整的流动细胞。为了排除计算单个细胞多次出现在连续帧中的可能性，对已识别细胞的每个连续帧进行进一步分析。需要注意的是，鼠标腿被仔细定位，以便 GSV 壁和血流沿显示器中的对角线方向显示。在 250 μm 的成像视野内，观察到大部分流动细胞的轨迹与 GSV 壁相对平行，偏差为 ± 15°。因此，对于连续帧中出现的已识别单元格，如果单元格位置之间的连接轨迹偏离GSV壁小于15°，则认为它们是单个单元格出现在多个连续帧中。3. 结果
3.1.GSV 处静脉注射循环 CT26 细胞的体内成像
我们使用图 1 所示的定制视频速率激光扫描共聚焦显微镜系统对 GSV 的循环肿瘤细胞 (CTC) 进行直接成像。之所以选择 GSV 作为成像部位，是因为 GSV 是大腿的浅表静脉，可以通过最小的手术轻松进入，并且 GSV 可以紧密固定以最大限度地减少运动伪影。此外，GSV 是全身最大的静脉之一，其循环的血液比小毛细血管多三个数量级，为体内流式细胞仪分析提供大量血液。为了验证所实施系统的能力，我们将用绿色荧光染料、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 标记的 CT26 结肠直肠癌细胞静脉注射到野生型 BALB/c 小鼠中。注入CT26细胞数为106. 此外，为了观察 GSV 中的血浆，还静脉注射了 100 μg 红色荧光 TAMRA-葡聚糖。如图2（a）所示，我们成功地获得了GSV中流动的CT26细胞的清晰图像。然而，很容易注意到，随着大小超过7.5μm的CT26细胞，检测到大量绿色荧光小物体，其中大部分是细胞碎片，而不是完整的循环CT26细胞。为了从 CTC 定量中排除这些小片段，我们开发了一种图像处理算法，如第 2.4 节所述。它顺序执行单个对象的识别，计算其大小，去除小于阈值的对象，最后计算每个图像帧中的对象。图 2(a) 显示了具有各种对象大小阈值的原始图像及其图像处理结果。每行显示增加大小阈值的结果。红色圆圈标记通过增加大小阈值删除的对象。在这项工作中，我们使用 7.5 μm 作为大小阈值来计算完整的 CTC。图 2(b) 显示了从静脉注射 20 分钟后的那一刻起循环 CT26 细胞的时域动力学。每个符号代表不同物体大小阈值下 30 秒内检测到的 CT26 细胞数。静脉注射后检测到的循环CT26细胞数稳步增加，并在1.5分钟达到最大值。这表明静脉注射的细胞需要一段时间才能均匀地混合到全身循环的血液中。然后，它在 2 分钟内迅速下降到最大值的 10% 以下。使用较小的对象大小阈值，计数对象的数量显示出相似的动力学，但在前 3 分钟内存在显着差异。这些差异在稍后的时间点变得非常小，如图 1 的插图所示。图 2.大隐静脉 (GSV) 静脉注射循环 CT26 结直肠癌细胞的体内成像，(a) 随着物体尺寸阈值增加的原始图像和处理结果，(b) 检测物体数量的时域动力学具有不同的对象大小阈值。插图显示了 IV 注射后 15-20 分钟内的放大曲线。比例尺，20μm。IV 注射 CT26 细胞及其片段的集体时域动力学的详细分析是通过大小相关的循环物体计数进行的。图 3(a) 显示了表示在不同尺寸类别中检测到的循环物体在 1 分钟内的尺寸分布的直方图：2.0-2.5 μm、2.5-3.5 μm、3.5-4.5 μm、4.5-5.0 μm、5.05.5 μm、5.5-6.0微米、6.0-6.5微米、6.5-7.0微米、7.0-7.5微米和≥7.5微米。在IV注射后1-2分钟，检测到的小于2.5 μm或2.53.5 μm范围的细胞碎片数量与大于7.5 μm的完整CT26细胞一样多。然而，5 分钟后，尽管绝对数量显着减少，但代表完整循环 CT26 细胞的大于 7.5 μm 的尺寸类别成为最常检测到的尺寸类别。图 3(b) 显示了检测到的物体大小分布随时间的变化。在 1-2 分钟时，完整的 CT26 细胞在总检测对象中的比例低于 20%。5分钟后，它几乎变成了50%。集体，循环 CT26 细胞的快速消失和前 3 分钟内大量小细胞碎片的观察表明，静脉注射的 CT26 细胞遭到大量破坏，这些细胞突然暴露于极端恶劣的血液循环环境，如大剪切应力、高血清蛋白浓度和心脏泵血压力。CT26细胞IV注射后1小时处死小鼠，解剖肝、脾、肺三个主要器官。有趣的是，在肝脏和脾脏中观察到的 CT26 细胞数量非常少。另一方面，在肺部观察到大量的CT26细胞和绿色荧光碎片，这表明CTC可以很容易地被肺部密集而曲折的肺泡毛细血管网络捕获。高浓度的血清蛋白和心脏泵血压力。CT26细胞IV注射后1小时处死小鼠，解剖肝、脾、肺三个主要器官。有趣的是，在肝脏和脾脏中观察到的 CT26 细胞数量非常少。另一方面，在肺部观察到大量的CT26细胞和绿色荧光碎片，这表明CTC可以很容易地被肺部密集而曲折的肺泡毛细血管网络捕获。高浓度的血清蛋白和心脏泵血压力。CT26细胞IV注射后1小时处死小鼠，解剖肝、脾、肺三个主要器官。有趣的是，在肝脏和脾脏中观察到的 CT26 细胞数量非常少。另一方面，在肺部观察到大量的CT26细胞和绿色荧光碎片，这表明CTC可以很容易地被肺部密集而曲折的肺泡毛细血管网络捕获。图 3. 在 GSV 检测到的循环肿瘤细胞和细胞碎片的大小依赖性分析，（a）表示不同时间点检测到的循环物体的大小分布的直方图，（b）检测到的物体大小分布的时间依赖性变化。3.2.全身循环肿瘤细胞的体内定量
如第 3.1 节所述，大多数静脉注射 CT26 结直肠癌细胞迅速从血液循环中消失。只有一小部分 CT26 细胞存活并作为 CTC 循环。相比之下，当我们静脉注射由远红荧光团 DiD 标记的红细胞 (RBC) 时，在 GSV 检测到的循环 RBC 数量在 60 分钟内保持在相似水平。这表明大部分红细胞在血液循环中存活并保持循环。通过利用红细胞作为维持在全身循环中的绝对标准测量值，我们可以估计循环 CT26 细胞的总数。图 4（a）显示了 GSV 中的循环 CT26 细胞和 RBC，由定制的共聚焦显微镜平台以视频速率（30 帧/秒）捕获。图 4(b) 显示了从静脉注射 60 分钟后的那一刻起循环 CT26 细胞和红细胞的时域动力学。每个符号代表检测到的 CT26 细胞数或 30 秒。注射的 CT26 细胞和红细胞总数各为 100 万。与之前的观察相似，随后在 1 分钟达到最大值，循环 CT26 细胞的数量迅速减少，然后在 1 小时内平均保持在每 30 秒约 9.7 ± 2.2 个。图 4.通过对全身静脉注射红细胞的血细胞计数分析进行体内CTC 定量，（a）以视频速率（30 帧/秒）在 GSV 中捕获的快速流动 CT26 细胞和 RBC 的代表性图像。(b) 静脉注射后在 GSV 处检测到的循环 CT26 细胞和红细胞的数量。3 分钟后，CT26 细胞和红细胞的平均数量分别保持在每 30 秒 ~9.7 ± 2.2 和 ~122.8 ± 13.6。(c) 3 分钟至 1 小时后循环 CT26 细胞和红细胞的分布。比例尺为 20μm。相比之下，循环 RBC 的数量在 1 小时内保持在最初达到的峰值，每 30 秒 ~122.8 ± 13.6，如图 4(b)-4(c) 所示。由于总循环 RBC 的数量可能为 100 万，将 30 秒检测到的细胞计数转换为血液循环中的总细胞计数的相对校准因子计算为 8,143。因此，从静脉注射后 3 分钟到 1 小时，全身循环 CT26 细胞总数可估计为 78,990。4. 结论
在这项研究中，我们实现了一个基于快速旋转多面镜的定制设计小动物活体原位细胞分析成像系统，该系统可以以每秒 30 帧的速度获取亚微米分辨率的图像。分别静脉注射CFSE和DiD荧光标记的CT26大肠癌细胞和红细胞后，我们成功获得了活体动物模型中大隐静脉（GSV）中单个流动细胞的清晰图像. 通过连续视频速率成像采集，我们监测了循环 CT26 细胞和红细胞的时域动力学。为了可靠地计数与细胞碎片区分开来的完整循环细胞，我们开发了一种图像处理算法，用于识别单个物体、计算其大小并去除小于阈值的物体。在 GSV 检测到的循环 CT26 细胞数量在注射后立即迅速增加，并在 1.5 分钟达到最大值。然后在 2 分钟内迅速下降到最大值的 10% 以下。同时，检测到大量细胞碎片，表明由于血液循环条件恶劣，CT26细胞被大量破坏。有趣的是，虽然超过 90% 的注射 CT26 细胞在前 3 分钟内被破坏，在初始动态变化后，循环 CT26 细胞的数量在 1 小时内保持在相似水平，表明存在长循环 CT26 细胞。另一方面，循环红细胞的数量在1小时内保持在最初达到的最大值，这表明大多数静脉注射的红细胞可以在血液循环中存活。同时静脉注射 10 剂 3 分钟后6 个CT26 细胞和 RBC，循环 CT26 细胞和 RBC 的数量在 1 小时内平均保持在每 30 秒 ~9.7 ± 2.2 和 ~122.8 ± 13.6。通过使用红细胞作为绝对标准测量，初始大规模破坏后全身循环中循环 CT26 细胞的总数估计为 78,990，这表明最初注射的 CT26 细胞中只有约 7.9% 在血液循环中存活。需要注意的是，不仅可以通过使用新提出的体内流式细胞术分析方法对 CTCs 以及其他血液循环细胞进行定量，这可能是使用临床前动物模型进行各种人类疾病研究的有力工具。如需索取更多资料或者技术支持欢迎联系我们~上海埃飞电子科技有限公司地址：
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